Ölümden dirilen ve başka seçeneği olmadan insan yanlısı bir organizasyona katılmak zorunda kalan Komutan Shepard, galaksiyi bir kez daha tamamen yok olmaktan kurtarmak için bir ekip kurmalı, yeni bir tehditle savaşmalı ve zor seçimler yapmalıdır.
İlk Mass Effect'in sona ermesinin ardından Shepard ve gemisi Normandiya, daha fazla geth direnişini ortadan kaldırmak için görevlendirilir. Uzayda devriye gezerken Normandiya bilinmeyen bir geminin saldırısına uğrar. Mürettebatın çoğu Normandiya'dan kaçar ama Shepard öldürülür. Neyse ki, Shepard'ın cesedi, Shepard'ın da parçası olduğu İttifak ile anlaşmazlığa düşen, insan yanlısı bir örgüt olan Cerberus tarafından alınır ve yeniden canlandırılır. İki yıl sonra Shepard, Cerberus'un lideri Hayali Adam'dan çok sayıda insan kolonisinin yok olduğunu öğrenir, ancak ikincisi bunun nedenini bilmiyor. Shepard, yakın zamanda bu bilinmeyen savaşçıların saldırısına uğrayan bir koloniyi ziyaret ettikten sonra, savaşanların aslında Koleksiyoncular olduğunu, yani Normandiya'nın düşürülmesinin ardındakiyle aynı türün olduğunu öğrenir. Koleksiyoncuların ana dünyasına saldırmak intihar olur. Koleksiyoncuların oluşturduğu bu büyüyen tehdide yanıt olarak Shepard, ilk Mass Effect'teki eski ekip üyelerinden ve yeni üyelerden oluşan bir ekip oluşturur. Ancak Shepard'ın aynı zamanda Koleksiyoncuların mümkün olan en az kayıpla karşı karşıya gelmesi için gerekli hazırlıkları yapması gerekiyor.